최근 Oncology에서 Immunotherapy만큼 핫한 주제가 없는 것 같다. 그중에서도 Checkpoint Inhibitor와 함께 빠지지 않고 등장하는 주인공은 바로 CAR-T. 

2017 FDA 첫 CAR-T 허가를 전후로 $11.9B / $9B 이라는 초대형 M&A의 역사가 쓰여지면서, CAR-T 에 대한 관심이 매우 높아지고 있다. 비싼 약가, 부작용 등의 많은 이슈가 달려 있는 상업화 초기 단계의 기술이지만, 향후 면역항암의 한 축이 될 기술이라고 생각한.

Checkpoint Inhibitor의 대장주인 Keytruda는 2014년에, Yervoy는 그보다 앞선 2011년에 허가를 받으며 이미 폭발적으로 사용되고 있는 만큼 관련된 공부자료와 잘 정리된 내용도 매우 많기에, 이제 막 허가 첫돌을 맞이하는 CAR-T에 대해 정리해보고자 한다.

 


(Source: Genetic Engineering & Biotechnology News)



Contents

Intro
1. Adoptive Cell Transfer
1.1. ACT란?
1.2. TIL Therapy
1.3. CAR/TCR Therapy
2. CAR-T Workflow
3. CAR-T Manufacturing
3.1. T세포의 추출 및 활성화
3.2. CAR 유전자 도입
3.3. CAR-T세포 배양
3.4. Additional Information
4. CAR-T의 구조 및 발전과정
4.1. CAR-T의 구조
   4.1.1. Extracellular Domain
   4.1.2. Transmembrane Domain
   4.1.3. Intracellular Domain
4.2. 세대별 CAR-T의 진화
   4.2.1. 1세대 CAR-T
   4.2.2. 2세대 CAR-T
   4.2.3. 3세대 CAR-T
5. 개발 현황
5.1. 혈액암 대상 CAR-T
5.2. 고형암 대상 CAR-T
6. Side Effects
7. Next-Generation CAR-T
7.1. 암세포의 Targeting 능력을 높여주는 방식
   7.1.1. Self-Driving CAR-T
   7.1.2. Tandem CAR-T
   7.1.3. Dual (Trans-Signaling, Dissociated-Signaling) CAR-T
7.2. 면역체계 활성화를 촉진하여 공격력을 높여주는 방식
   7.2.1. TRUCK
   7.2.2. Armoured CAR-T
7.3. 부작용을 억제하는 방식
   7.3.1. Universal (Allogeneic, Off-the-Shelf) CAR-T
   7.3.2. Marked CAR-T
   7.3.3. Safety (Inhibitory CAR-T)
7.4. Customizing하여 원하는 대로 조작하는 방식
   7.4.1. Self-destruct CAR-T (Safety Switch, Suicide Gene)
   7.4.2. Conditional CAR-T
   7.4.3. SUPRA CAR-T
7.5. 끝없는 CAR-T의 진화
8. 국내 CAR-T 관련업체 소개
8.1. 암세포 Targeting 능력을 높여주는 방식: 바이로메드, 앱클론, 유틸렉스, 페프로민바이오(바이넥스)
8.2. 공격력을 높여주는 방식: 큐로셀, 툴젠
8.3. 고형암 대상: 유영제약
8.4. 그 외: 녹십자셀, 바이오큐어팜-파로스백신, 박셀바이오, 이뮨온시아-유한양행, LG화학
9. 기타 고려사항들
9.1. 높은 약가 및 Reimbursement
9.2. 중국, 중국, 중국
9.3. Logistics
Outro



Introduction

소아에게서 발생하는 급성 림프구성 백혈병(ALL)로 진단받은 아이들은 대부분 높은 강도의 chemotherapy를 받게 되는데, 이마저도 효과가 없는 경우는 치료법이 거의 존재하지 않았다. 그러던 중 Novartis CD19 antigen targeting하는 CAR-T 세포치료를 이러한 난치성 소아ALL 환자들을 대상으로 임상을 진행하여 2상에서 63명의 환자 중 52명이 반응하는 결과를 이끌어냈고, 이를 기반으로 2017 8 FDA는 세계 최초의 CAR-T 치료제인 Kymriah를 허가게 된다.
 
CD19 Targeting하는 CAR-T가 소아, 성인 대상의 ALL 뿐만 아니라 DLBCL (Diffuse Large B-Cell Lymphoma) 환자들에게서도 약효를 보이는 것이 확인된 이후, Kite Pharmaceuticals에서는 101명의 DLBCL 환자를 대상으로 진행한 임상에서 72%의 반응률을 얻어내는 데에 성공한다. 이후 2017 10 FDA Yescarta (axi-cel) 허가하였으며, 개발사인 KITE $11.9B라는 금액으로 GILD 품에 안긴다그리고 얼마 뒤인 2018년 1월, Celgene은 또다른 CAR-T 개발사인 Juno를 $9B에 인수한다. 
 

CAR-T 개발사인 KITE와 JUNO. 이 두 회사의 몸값을 합치면 $21B, 약 23조원에 달한다. 이정도 액수는 코스피 시총 상위 10~15위권 정도에 있는 LG생활건강, 한국전력, 신한지주, SK텔레콤 쯤 되는 금액이며, 코스닥 시총 1위인 셀트리온헬스케어 의 약 1.5~2배일 뿐만 아니라 현대차의 삼성동 땅을 2개정도(?!) 살 수 있는 금액이다. 도대체 CAR-T가 뭐길래...



1. Adoptive Cell Transfer


1.1. ACT란?
CAR-T를 활용한 치료는 ACT (Adoptive Cell Transfer)의 일종으로 분류되며, 더 큰 범위에서 이는 T Cell Therapy한 종류이다. 항체를 활용한 치료법인 Bispecific Antibodies, Checkpoint Inhibitors 등에 대해서는 향후 별도로 분석하고자 하며, 우선 ACT에 한정지어 논의를 시작해보고자 한다.
 


ACT (Adoptive Cell Transfer/Therapy)의 가장 기본적인 컨셉은, 암 환자 본인의 T세포를 활용하여 체외에서 이를 강화/배양한 뒤, 다시 환자에게 주입하여 암세포를 사멸시키는 방식으로 진행된다. 이때 재주입하는 T세포 이외의 체내 면역세포들을 모두 사멸시키는 Lymphodepletion이 따라붙게 되는데, 이는 T세포의 활성을 억제하는 Treg 세포 및 Homeostatic Cytokines (IL-7, IL15 )을 제거하여 T세포의 공격력을 극대화하기 위함이다.
 
ACT를 크게 분류하자면, 자연적으로 존재하는 T세포를 활용하는 방식(TIL), Genetically Engineered T세포를 활용하는 방식(TCR, CAR)이 있다. 혹은 항체를 활용하여 암환자 체내에서 Lymphocyte를 활성화시키는 방식(Bispecific Antibody, Checkpoint Inhibitors)이 있다.
 
1.2. TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) Therapy
 

 
TIL Therapy는 혈액을 빠져나가 종양 주변의 미세환경으로 파고들어간(infiltrating) 면역세포들에 의한 항암 작용으로, 1988 Metastatic Melanoma 환자들에게 처음 사용된  있다. 다만 종양의 일부분을 떼어내야 하는 침습적 치료라는 점, 그렇기에 Melanoma 등 특정 암종 이외에는 확장이 불가능하다는 점 등의 치명적인 약점을 갖고 있다. 이러한 TIL의 단점을 해결하기 위해 특정 암세포와 선택적으로 결합할 수 있는 Antigen Specificity가 중요하다는 점에 집중하기 시작하면서, TCR/CAR 치료가 떠오르게 된다.
 
1.3. TCR / CAR Therapy


TCR-T Therapy와 CAR-T Therapy, Peripheral T세포를 추출하여 특정 항원을 인식하는 수용체를 표면에 발현시킨다는 점에서 비슷하다고 할 수 있다. 

다만 아래 그림에서 볼 수 있듯이, 발현시키는 수용체의 세부 구조에는 차이가 있다. 
일반적인 T세포에는 TCR이 발현되는데, 이는 alpha, beta, gamma, deltaheterodimer 형태로 존재하며 T세포 내부로의 신호전달을 위해 6개의 subunit으로 구성된 CD3와 함께 붙어있다(TCR/CD3 complex).
TCR-T 치료에 사용되는 TCR은 이 중 alpha, beta chain만을 가져와서 사용하며, CAR TCR/CD3 complex signaling domain 일부분과 항체의 일부분을 섞어서 만든 수용체이다.

(Source: Creative Biolabs



먼저, TCR-T 세포는 특정 항원을 인식할 수 있는 TCR 수용체를 발현시킨 T세포를 활용한 치료로, MHC를 통해 제시된 항원을 인지하기 때문에 세포 내부에 있는 항원(intracellular antigen) targeting 할 수 있다는 것이다. 다만, 역으로 항원이 MHC를 통해 제시되어야만 TCR-T세포에게 인지되기 때문에, TCR을 Downregulation하는 암세포에게는 효능을 보이지 못하는 문제점이 존재한다.
 
이러한 TCR-T세포의 문제점을 개선하고자, MHC를 통하지 않고 항원을 인지하는 CAR-T세포가 개발되었다. CAR-T세포는 특정 항원과 결합할 수 있는 항체의 성질을 활용하였고, HLA Type  Antigen Processing과 상관없이 다양한 암세포를 Targeting할 수 있게 되면서 비로소 CAR-T의 세계가 열리게 된다.
 
 
           Further Reading
TIL, TCR, CAR에 대한 간략한 개요와 함께 Adoptive Cell Transfer에 대해 살펴보면서, TIL TCR-T를 거쳐 CAR-T로 이어지는 흐름을 느낄 수 있었다. 
이와 관련하여 ACT, 특히 CAR의 개발 역사와 초창기 (1980~90년대) 연구 결과 등에 대해  정리해놓은 이 있어 추가적인 History를 공부하기에 유용하다. Facebook 그룹에 올라온 글로, <A Cure Within>이라는 책에 대한 소개와 함께 자세한 설명이 되어 있다.
 

Reference
Rosenberg, Steven A., and Nicholas P. Restifo. "Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer." Science 348.6230 (2015): 62-68.
June, Carl H., et al. "CAR T cell immunotherapy for human cancer." Science 359.6382 (2018): 1361-1365.
Houot, Roch, et al. "T-cell–based Immunotherapy: Adoptive Cell Transfer and Checkpoint Inhibition." Cancer immunology research 3.10 (2015): 1115-1122.
Harris, Daniel T., and David M. Kranz. "Adoptive T cell therapies: a comparison of T cell receptors and chimeric antigen receptors." Trends in pharmacological sciences 37.3 (2016): 220-230.
Creative Biolabs, "Comparison between CAR-T and TCR-T" (2017)
Rosenberg, Steven A., et al. "Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy." Nature Reviews Cancer 8.4 (2008): 299.
 
 
 

2. CAR-T Therapy Workflow
 
기본적인 컨셉은 아래와 같다.


 
(1) 먼저, 환자의 혈액을 추출한다.
(2) 이후 혈액으로부터 T세포를 분리한 뒤, anti-CD3/CD28 Ab를 활용하여 T 세포를 활성화한다.
(3) 여기에 CAR를 발현하는 유전자를 viral vector를 통해 도입한다. 이때 도입되는 CAR는 특정 antigen targeting하는 성질을 갖고 있으며, 이것이 CAR-T Therapy의 가장 핵심적인 부분이라고 할 수 있다.
(4) CAR가 도입된 T세포들을 각종 Growth Factor를 사용하여 증식시킨 뒤,
(5) 충분한 숫자가 모이면 성능 test를 한 뒤에 환자가 있는 곳까지 이동하기 위해 동결을 진행하게 된다.
(6) 이렇게 제작된 CAR-T 세포들은 환자에게 IV로 주입되며, 향후 이들에 의한 치료효과 및 부작용 등을 Monitoring 하면 끝.
 
 

(Source: Time, 2017)



           

3. CAR-T Manufacturing
 

현재 사용되고 있는 CAR-T는 환자 본인에게만 사용할 수 있어서, 위 그림에서 보듯이 약봉투에 직접 이름도 찍혀서 나온다. 나름의 환자 맞춤형 치료인 CAR-T의 제작 과정을, 생산 관점에서 좀 더 자세히 살펴보자.
 
 

(Source: S Han, 2016)



                      3.1. T세포의 추출 및 활성화
환자에게서 추출한 혈액으로부터 T세포를 분리해낼 때, 어떤 종류의 T세포를 사용할 것인지가 우선 결정되어야 한다. 일반적으로는 혈액 내에 존재하는 CD3+ T세포를 활용하게 되는데, 다만 CD4+/CD8+ T세포의 구성비율에 따라 암세포 사멸효과 및 정상세포에의 영향 등이 차이가 있다는 것이 알려져 있다. (그렇다면 최적 비율에 대한 연구도 어디에선가 진행되고 있을 듯 하다…)
 
사용할 T세포들을 골라내고 나면, CAR유전자를 도입하기 이전에 우선 이 T세포들을 활성화시켜주어야 한다. 이 과정에서도 동일하게 Stimulatory/Costimulatory Signal이 필요한데, 이는 anti-CD3/anti-CD28 Ab-coated beads를 활용한다. CD3 T세포의 stimulatory signal, CD28 costimulatory signal로 작용하기 때문에 이를 T세포와 반응시키면 T세포가 활성화되는 원리이다. 이때 T세포 활성화 효율을 높여주기 위해 IL-2와 같은 cytokine을 넣어주기도 하며, 인공적으로 만든 artificial APC를 활용하여 약화된 암세포의 일부를 제시해주기도 한다.
 
                      3.2. CAR 유전자 도입
T세포가 활성화되고 나면 CAR유전자를 발현시키기 위한 유전자 도입이 진행되는데, 주로 Viral Transfer를 이용하게 된다. 초기 유전자 치료에 성공했던 임상시험에서는 SCID 환자의 치료를 위해 Retrovirus를 사용한 바 있으며, 2013년 조사한 바에 따르면 약 20% 정도가 CAR 유전자 도입을 위해 Retrovirus를 사용한다고 한다. Lentivirus의 경우 Retrovirus와 달리 세포분열주기와 무관하게 작용하기 때문에 분열하지 않는 세포에도 도입이 가능하다는 장점이 있다.
 
Virus를 이용하지 않는 경우도 있다. 대표적으로 transposon/transposase system(“Sleeping Beauty”)의 경우 viral system에 비해 훨씬 쉽고 비용이 낮은 장점이 있지만, 도입 효율이 낮다는 단점이 있다. PiggyBac Transposon을 사용해서 CAR-T를 제조하는 회사로는 Poseida 등이 있다.  이외에도 유전자 도입 방식에 따른 장단점에 대한 연구는 아래 표를 참조.
 

(Source: MM D'Aloia, 2018)



                     3.3. CAR-T세포 배양
추출 후 활성화된 T세포에 CAR 유전자가 도입되면 CAR-T가 만들어지며, 이를 환자에 다시 주입하기 이전에 CAR-T 세포의 수를 늘리는 배양 작업이 필요하다. 이는 최초 T세포 활성화와 비슷하게 cytokine, APC 등을 활용하게 된다
T세포가 체내에서도 활성을 갖도록 하는 것이 중요하며, CAR-T 주입 이전에 lymphodepleting 과정을 거치는 것이 치료의 효율을 더 높여주는 것으로 알려져 있다.

                     3.4. Additional Information
CAR-T 생산에 대한 좀 더 자세한 정보는  논문에 자세히 정리되어 있다. 환자 혈액 채취부터 T세포 전처리, CAR-T 제작, 배양 및 Logistics까지 설명되어 있으며, 여기서는 그림으로 설명을 대신하고자 한다.
 









(Source: BL Levine, 2016)



Reference
D’Aloia, Maria Michela, et al. "CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors." Cell death & disease 9.3 (2018): 282.
Levine, Bruce L., et al. "Global manufacturing of CAR T cell therapy." Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 4 (2017): 92-101.



4. CAR-T의 구조 및 발전과정

4.1. CAR-T의 구조
CAR-T는 "CAR를 발현하고 있는 T세포" 이므로, 결국 핵심은 CAR가 어떻게 생겼는지가 중요하다. 
이름에서처럼 chimeric의 형태를 갖고 있는데, TCR Antibody chimera로 이해하면 쉽다. 크게 Domain 별로 Extracellular – Transmembrane – Intracellular로 구분할 수 있다.
 


(Source: S Han 2016)


4.1.1. Extracellular Domain
항체를 인식하는 부위로, 항체의 heavy/light chain에 있는 scFv (single chain variable fragement)에서 유래한다. 특정 항원을 인지하여 결합할 수 있는 항체의 성질을 그대로 가지고 온 것이기에, CAR-T세포 역시 특정 항원을 인지할 수 있는 능력을 갖게 되며,  Extracellular Domain에 오는 scFv가 어떤 항체의 것인지에 따라 결합하는 antigen의 종류가 정해지게 된다고 할 수 있다
Antigen Specificity를 갖게 해주는 것이 scFv CAR-T에서 갖는 가장 기본적이고 중요한 역할이지만, mouse 유래 항체에서 유래한 scFv가 부작용을 나타낸다는 연구 결과를 보면 scFv가 유래한 항체의 성질도 고려해야 하는 것으로 보인다. 특히, 어떤 Target을 대상으로 하는 CAR를 개발할 것인지를 비롯하여 고형암으로의 확장 등에서 건드리는 곳이 바로 이 scFv 부위이기 때문에, 이와 관련된 많은 연구들이 진행되고 있다.
 
중간에 있는 Linker heavy chain light chain을 이어주는데, 반복적인 아미노산 서열로 구성되며 CAR의 항원 결합력(affinity)을 높여주는 역할을 한다
Transmembrane으로 이어지는 부분에 있는 Hinge Domain 역시 위와 아래를 이어주는 역할로, 주로 CD8 혹은 IgG4에서 유래한다. 이 부분 역시 단순히 이어주는 역할 이외에도, 길이나 sequence 등에 따라 움직일 수 있는 결합영역이 달라지기에 Antigen binding이나 T-cell expansion 등에 관여한다는 결과들이 있다.
 
                      4.1.2. Transmembrane Domain
Antigen 인지를 담당하는 Extracellular Domain, Signal Transduction을 담당하는 Intracellular Domain을 연결시켜주는 부분이다. 좀 더 자세하게는, extracellular scFv intracellular CD3-zeta ITAM domain을 연결시켜준다. 세포막을 통과해야 하기에 hydrophobic alpha helix 구조 등으로 구성되며 주로 CD8 alpha, Immunoglobulin 등을 사용한다.
 
 
                      4.1.3. Intracellular Domain
외부에 있는 scFv Hinge를 통해 Transmembrane Domain으로 연결되어 세포막을 통과하며, 그 밑에는 Costimulatory / Stimulatory signal Molecule이 결합되어 있다.
 
Stimulatory Signal Molecule은 일반적으로 TCR (T Cell Receptor) CD3-zeta 부위를 사용하는데, 이 부위는 T세포의 활성을 유도하는 역할을 한다. TCR MHC와 결합하게 되면 CD3-zeta 부위에 있는 10여개의 ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) Domain을 인산화하게 되고, 이를 통해 singnaling cascade가 일어나서 T세포가 활성화되는 방식이다.
 
Co-stimulatory Signal Molecule CD28, CD134(OX40), CD137(4-1BB) 등 다양한 종류를 가져다 사용하게 되며, 말 그대로 Stimulatory Molecule과 함께 작용하여 T세포의 활성화를 돕는 역할을 한다. CD28은 이를 통해 활성화된 T세포의 clonal expansion과 초기 IL-2 분비를 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 4-1BB OX40의 경우 T세포의 long-term survival을 늘려주는 데에 도움을 주는 역할을 한다.
 

(Source: A Klampatsa 2017)

 

          4.2. 세대별 CAR-T의 진화
CAR-T 치료의 핵심이 특정 항원에 결합하는 T세포를 활성화시키는 방식인 만큼, T세포를 얼마나 효율적으로 활성화시키는지가 매우 중요하다. 그렇기에 CAR-T의 진화 단계를 논할 때에도, T세포에 활성화 신호를 전달하는 Intracellular Domain의 구조에 따라 분류하게 된다. 그에 따라 초기 1세대 CAR-T의 경우 Costimulatory Molecule 없이 Stimulatory Molecule만 존재하다가, 이후 2세대~3세대로 가며 Costimulatory Molecule이 점차 1~2개씩 증가하는 구조를 나타낸다.  
 
                     4.2.1. 1세대 CAR-T
1세대 CAR-T부터 좀 더 자세히 살펴보자. 초기에는 T세포를 활성화시키기 위해 필수적인 신호전달 부분인 CD3-zeta chain이 가장 널리 사용된다. 다만 결정적으로 CD3-zeta chain만으로는 T세포를 충분히 활성화시킬 수 없다는 단점이 있다. 이러한 CAR-T세포는 체내에서 수명이 짧으며, 암세포를 죽일 수 있을 만큼의 충분한 IL-2를 생성하지 못하기 때문에, 외부에서 IL-2를 함께 주입해야 효과가 크게 나타.
 
                     4.2.2. 2세대 CAR-T
2세대 CAR-T, 1세대 CAR-T의 단점이었던 낮은 공격력과 짧은 수명을 개선한 방식이다. TCR MHC와 결합할 때는 달랑 8~12개의 amino acid로 구성된 짧은 peptide만 가지고 결합하기 때문에, 비슷한 구조를 가진 정상세포에 대해서도 잘못 활성화되는 것을 막기 위해 costimulation signal이 있어야 본격적인 활성화가 시작되도록 되어 있다. 이러한 T세포의 활성화를 본격적으로 유도하기 위해 costimulatory signal을 추가하여 주는 것으로, 이를 통해 IL-2의 합성을 늘리고 apoptosis를 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다. 가장 대표적인 costimulatory signal로는 B7(CD80/86)과 결합하는 CD28이 있으며, CD137(4-1BB), CD134(OX40), CD27 등 또한 널리 사용되고 있다.
 
                     4.2.3. 3세대 CAR-T
3세대 CAR-T는 여기서 한발 더 나아가, 여러 개의 costimulatory signal을 연결시킨 구조이다.  2세대에서 언급된 CD28 + 4-1BB의 조합, 또는 CD28 + OX40 조합 등이 사용된다.
 
 
여기까지가 일반적으로 받아들여지는 CAR generation이다. 정리하자면, 1세대는 Single Stimulatory, 2세대는1개의 Costimulatory, 3세대는 2개의 Costimulatory Signal을 가지고 있는 구조이다. 최근 들어 다양한 부작용을 극복하거나 효능을 높이기 위해 다양한 방식의 “4세대” CAR-T가 개발되고 있는데, 이는 CAR에 대한 개론을 마친 뒤에 맨 마지막 부분에서 별도로 다루어 보고자 한다.  

 
Reference
Zhang, Cheng, et al. "Engineering CAR-T cells." Biomarker research 5.1 (2017): 22.
Abate-Daga, Daniel, and Marco L. Davila. "CAR models: next-generation CAR modifications for enhanced T-cell function." Molecular Therapy-Oncolytics 3 (2016).





5. 개발 현황


 

5.1. Hematologic Malignancies Targeting CAR-T

최초로 출시된 CAR-T인 Kymriah는 ALL을, 정확히는 relapsed/refractory B cell ALL을 대상으로 한다. 뿐만 아니라 Yescarta를 비롯하여 임상 개발이 가장 앞서있는 파이프라인은 대부분 혈액암을 적응증으로 하여 CD19 targeting하고 있는데, 이는 기본적으로 혈액을 타고 움직이는 CAR-T 세포가 암세포에 도달하기 쉬우며 혈액암의 원인이 되는 B 세포에 CD19가 명확하게 발현되기 때문이다


(Source: Targeted Oncology, 2017.11)



혈액암에 대해 조사하다보면 lymphoma, leukemia, myeloma 등 비슷한 암 용어들과 세부 분류에 따라 줄임말로 부르다 보니 ALL, CLL, DLBCL 등 L 시리즈들이 계속해서 나오면서  헷갈리는 경우가 많는데, 이들에 대한 이해를 하는 것이 먼저일 듯 하다. 혈액을 구성하는 성분에 생기는 암을 포괄적으로 지칭하여 혈액암(blood cancer)로 지칭하며, 어디에 암이 생겼는지에 따라 세부 구분이 가능하다. 


먼저 림프종(lymphoma)은 말 그대로 전신에 흐르고 있는 림프관 내의 림프구(lmphocyte)의 문제로 인한 것으로, 대표적인 림프절인 흉성/비장 뿐만 아니라 소화기관, 뼈 등에서 악성 림프구가 증식하기 시작하면서 발병하게 된다. 예후가 좋지 않은 비호치킨성 림프종(Non-Hodgkin Lymphoma, NHL)이 주요 림프종 약물들의 타겟이 되며, Kymriah/Yescarta가 타겟하고 있는 DLBCL (Diffuese Large B Cell Lymphoma)가 대표적인 NHL의 한 종류이다.


백혈병(leukemia)은 2가지 종류에 따라 구분된다. 진행향상에 따라 급성(Acute)과 만성(Chronic)으로, 암세포의 변화가 어디에 일어났는지에 따라 림프구성(lymphocytic) / 골수성(myelocytic)으로 나뉜다. 그에 따라 2x2 구조로 "급성(A)/만성(C) & 림프구성(L)/골수성(M)  백혈병(Leukemia)"의 네이밍이 붙고, 이를 줄여서 ALL/AML/CLL/CML로 부르게  된다.


이처럼 다양한 종류의 혈액암 중 왜 CAR-T가 ALL/DLBCL을 우선적으로 개발되었는지, 또한 세부 lymphoma/leukemia에서 어떤 효능을 보이는지 등에 대해서는 각각 이 논문 이 논문을 참조하면 좋을 것 같다. 여기서는 "악성 B세포를 공격하는 CAR-T가 다양한 혈액암에서 좋은 효능을 보이는구나" 정도로만 이해하고 넘어가도록 하겠다.




5.2. Solid Tumor Targeting CAR-T

CAR-T에 대해 공부하다 보면, 최근의  Focus는 "Off-the-Shelf"와 "Solid Tumor"에 맞춰져 있다는 얘기가 자주 보인다. 아래 Solid Tumor에 대한 개발 현황을 먼저 살펴보자.  상당히 많은 Target들을 대상으로 개발이 진행되고 있는데, 막무가내로 이타겟 저타겟 하다보면 전혀 감이 안잡히기 때문에 왜 저런 타겟들을 대상으로 개발하고 있는지를 파악하는 과정이 선행되어야 한다고 생각한다. 아래의 EGFR, HER2, Mesothelin, MET, CD133, CD171, MUC1 등 다양한 고형암 Target들은, 고형암 대상 CAR-T가 갖는 단점을 기준으로 분류해보면 어느정도 큰 틀이 잡힌다.


(Source: Targeted Oncology, 2017.11)


CAR-T는 혈액암 이외의 대부분 고형암에 대해서는 여러가지 이유로 개발이 더딘 편이다. 


(1) 결정적으로는 혈액암에서의 CD19처럼 고형암 specific하게 발현되는 항원이 뚜렷하지 않다는 것이 가장 큰 문제인데, 발현된다 하더라도 혈액암에 비해 homogenousity가 떨어지는 편이다(Antigen Specificity and Heterogeneity). 

(2) 또한 체내로 주입된 CAR-T가 제기능을 발휘하기 윟위해서는 T세포가 암세포를 잘 발견할 수 있어야, 즉 T세포가 암세포에 의해 잘 붙잡힐 수 있어야(Trafficking) 한다. 

(3) 이외에도 고형암을 둘러싸고 있는 tumor microenvironment의 환경과 

(4) T세포가 스스로 비활성화 되려고 하는 Downregulation을 극복해야 하며, 

(5) 면역원성 및 독성의 문제 또한 중요한 이슈로 다뤄지고 있다. 


각 사항들에 대해 하나씩 자세히 살펴보자.

 


                     5.2.1. Antigen Specificity and Heterogeneity (EGFR, MUC-1, CEA, Mesothelin 등)

 CAR-T의 구조 중 결합 특이성을 결정하는 extracellular domain을 설명하면서, 어떤 target에만 선택적으로 결합할 수 있는지가 CAR-T의 가장 핵심적인 요소임을 살펴봤다. 이를 위해 혈액암에서의 CD19처럼, high specificity를 갖는 antigen을 고형암에서도 찾기 위해 많은 노력들이 진행되고 있다.

 

대표적으로 암세포 특이적인 mutation으로 인해 암세포에만 나타나는 neoantigen이 있다. 다만 이들은 태생이 mutation이기에 암세포 자기들 내에서도 꽤나 변이가 다양한 편이라 heterogeneity가 높음에도 불구하고, glioblastoma EGFRvIII (variant III), abnormal glycosylated MUC-1 등에 대한 연구 결과가 있다. 이외에도 암세포의 발생 과정에서 나타나는 antigen CEA (carcinoembryogenic antigen) target으로 하는 경우도 있다.

 

한발 양보해서, 암세포에만 발현되는 것을 찾기 힘들다면 일반 세포 대비 암세포에 특히 많이 발현되는 것을 찾는 방법도 있다. 이러한 컨셉의 접근이 Tumor-selective antigen인데, 대표적인 target으로 mesothelin이 있다. 이름대로 mesothelioma를 비롯하여 ovarian, pancreatic carcinoma에서 과다발현되는 항원으로, 이를 targeting하는 CAR-T에 대해서는 이미 상당한 연구가 진행되었다.

 


                     5.2.2. Trafficking (CCR/CXCR)

고형암세포의 특정 항원을 targeting 하는 CAR-T 세포를 제작하더라도, 실제 그 암세포를 성공적으로 공격하여 사멸시키는 것은 별개의 문제이다. T세포가 암세포를 인지하여 결합하기 위해서는 T세포의 chemokine receptor와 암세포의 endothelium에서 분비하는 chemokine 사이의 궁합이 필요하고, 이 과정을 매개하는 것들이 CCR/CXCR로 시작하는 수용체들이다. T세포가 아무리 충분한 receptor를 달고 있어도 암세포가 chemokine을 적게 분비한다면 T세포가 암세포를 인지하지 못하는 “mismatch”가 일어나게 되므로, T세포의 암세포 targeting 능력을 향상시키기 위해서는 암세포에 의해 T세포가 “trafficking”되는 확률을 높여주는 것이 중요한 것이다. 이를 위해 당연히 특정 암세포가 분비하는 chemokine을 더 잘 인지할 수 있는 receptor T세포에 발현시키거나, 혹은 그 암세포가 있는 부위에만 국소적으로 CAR-T세포를 투여하는 방법(local instillation)등이 개발되고 있다. 특히 local instillation (site-specific injection)의 경우, 특정 chemokine을 탑재한 “armed” oncolytic virus와의 병용투여에서 효능을 나타냈다는 연구 결과들도 있다.

 


                     5.2.3. Tumor Microenvironment

암세포들은 특이적인 "Tumor Microenvironment, TME(종양미세환경)"을 구축하고 있다. 아래 그림에서 볼 수 있듯이, 말 그대로 암세포를 둘러싸고 있는 주변 환경들이 암세포와 어떤 상호작용을 하고 있는가에 대한 연구 분야이다.


먼저, T세포의 공격을 억제시키는 물리적/생리적 장벽들이 있다.  암세포 특이적인 구조 및 높은 Tissue Pressure 등의 물리적 장벽과, Low Oxygen/pH 및 영양소의 고갈 등 생리적 장벽을 활용하는 식이다. 대표적인 예로 암세포의 indolamine deoxygenase가 있는데, 이 효소는 필수아미노산이자 T세포의 생장에 필수적인 Trp를 분해하게 되어 T세포를 억제하게 된다. 이를 막기 위해 indolamine deoxygenase를 억제해보겠다는 시도가 바로 최근 연이은 실패를 거듭하고 있는(?) IDO-1 inhibitor의 컨셉이기도 하다.


이외에도 암세포들은 PGE2/Adenosine 등의 Immunosuppresive soluble factor, TGF-beta/IL-10/IL-4 등의  inhibitory cytokine을 직접 분비하기도 하며, T세포를 억제시키는 세포들(Treg, MDSC, M-2 TAM, N-2 TAN 등)을 활성화하여 간접적으로 작용하기도 한다.


(Source: FR Balkwill, 2012)


 

                     5.2.4. T-cell Intrinsic Regulatory Mechanism

T세포를 억제시키는 다양한 경로들도 극복의 대상이다. 


대표적으로, 이 논문에서 T cell inhibitory receptors (PD-1, LAG3 등)로 인한 T세포 억제작용이 CAR-T의 효능을 감소시켰다는 결과를 설명하고 있다. 이것이 여러가지 checkpoint inhibitors들과의 병용투여를 시도하게 하는 배경으로 보인다.


또한 T세포 내부의 intracellular negative feedback loop를 작동시키는 T cell inhibitory enzyme (diacyglycerol kinase, SHP-1) 등을 막는 것 또한 중요한 것으로 알려져 있다. 


이외에도 T세포의 사멸을 유도하는 Fas (CD95) pathway 또한 억제의 대상인데, 일반적으로 암세포 주위에서는 Fas ligand의 분비가 높아져 Fas pathway가 활성화되는 방식으로 T세포가 비활성화되기 떄문이다.

 

                     5.2.5. Immunogenicity and Toxicity

현재까지 CD19 CAR-T에서 가장 널리 알려진 부작용인 Cytokine Storm이 고형암 대상 CAR-T에서는 심각한 수준으로 관찰되지 않는데, 이는 Leukemia 환자들에 비해 Solid Tumor 환자들의 CAR-T 세포 주입/활성화 정도가 상대적으로 낮기 때문으로 알려져 있다. 고형암 CAR-T의 부작용은 첫번째로 언급했었던 Antigen Specificity의 부족, 즉 off-target effect가 대표적이라고 할 수 있다. 한 예로, HER-2를 targeting하는 CAR-T를 주입하였지만 이것이 정상 폐세포의 HER-2를 공격하면서, 주입한지 15분만에 부작용이 나타나기 시작하여 5일만에 사망한 사례가 보고되었다고 한다. 

 

 

이러한 여러가지 어려움에도 불구하고, 긍정적인 것은 방금 나열한 것처럼 그 이유를 어느 정도 알고 있다는 것이 아닐까 싶다. 위에서 살펴본 것처럼 수많은 Solid tumor target으로 한 CAR-T가 개발되고 있다. 최초의 CAR-T가 허가되었을 때 업계로부터 지대한 관심을 받았던 만큼, Solid Tumor를 대상으로 한 CAR-T가 최초로 허가받는 것 역시 매우 중요한 Milestone으로 기록되지 않을까 싶다.

 

  


Reference

Newick, Kheng, Edmund Moon, and Steven M. Albelda. "Chimeric antigen receptor T-cell therapy for solid tumors." Molecular Therapy-Oncolytics 3 (2016).

Yong, Carmen SM, et al. "CAR T‐cell therapy of solid tumors." Immunology & Cell Biology 95.4 (2017): 356-363.

Castellarin, Mauro, et al. "Driving cars to the clinic for solid tumors.Gene therapy (2018): 1.


 


6. Side Effects


CAR-T 역시 부작용이 없을 수 없다. 기본적으로 T세포를 활성화하여 면역체계를 부스팅하는 컨셉의 치료이기에, 면역체계의 과다한 활성화가 대부분 문제의 주요 원인이다. 이를 개념적으로 이해하기 위해서, 아래 CAR-T가 작동하는 그림을 다시 한번 짚어보자. 


(Source: ML Davila, 2016)


1/ 주입된 CAR-T 세포는 CD19를 타겟팅하여 문제가 있는 B세포를 잡아내는 능력이 있다. 이 기능만 하면 좋겠지만...

2/ T세포과 활성화되는 과정에서 Cytokine이 대량 방출될 수도 있고, (CRS;Cytokine Release Syndrome)

3/ 과다한 증식으로 이어질 수도 있다.

4/ 또한 BBB를 통과할 경우 CNS를 건드릴 수도 있고, (Neurotox)

5/ 멀쩡한 B세포도 CD19가 있다는 이유만으로 살상당할 수도 있다. (B cell Aplasia)




(Source: CL Bonifant, 2016)



이러한 CAR-T의 다양한 부작용들은 향후 CAR-T가 개선되어야 할 방향을 제시해주기도 한다. 실제로 다양한 방법을 통해 위와 같은 부작용을 최소화하고자 하는 방식으로 CAR-T가 진화되고 있으며, 이들을 우리는 "Next Generation CAR-T"라고 부른다.



Reference

Bonifant, Challice L., et al. "Toxicity and management in CAR T-cell therapy." Molecular Therapy-Oncolytics 3 (2016).

Neelapu, Sattva S., et al. "Chimeric antigen receptor T-cell therapy—assessment and management of toxicities." Nature Reviews Clinical Oncology 15.1 (2018): 47.




7. Next Generation CAR-T

 

(Source: Creative Biolabs)


위 <4.2. 세대별 CAR-T의 진화>에서 CAR의 구조를 설명하며 1~3세대 CAR-T에 대해 살펴보았다. 1세대, 2세대 등을 정의하는 용어가 조금씩 다르게 사용되고는 있지만, 여기서는 세대가 진화함에 따라 T세포를 활성화시키는 co-stimulatory molecule의 종류가 많아져 T세포를 좀 더 잘 활성화하는 방식으로 진화해왔다고 이해하고자 한다.


T세포가 충분히 활성화될 수 있는 수준까지 개발되었다면, 그 다음은 "우리가 원하는 대로" CAR-T세포들을 가지고 놀 수 있는 방식이 될 것이다. 이는 off-target effect나 과발현 등 부작용을 줄이는 방향이 될 수도 있을 것이고, 암세포를 정확히 찾아갈 수 있도록 하거나 T세포의 살상능력을 높이는 등의 방식이 될 수도 있을 것이다 . 이처럼 우리가 원하는 여러가지 기능들을 하나 둘 추가한 다양한 종류의 CAR-T들이 개발되고 있고, 이들을 통칭하여 4세대, "Next-Generation" CAR-T라고 부른다.


이러한 Next-Generation CAR-T들은 그 기능이나 특징에 따라 만든 사람 마음대로 이름을 붙이는 과학자들의 특성 상(?) 다양한 이름과 variation을 가지고 있어 정리하기가 참 난해한데, CAR-T의 대가이신 Upenn Perelman의 Carl June 교수님이 작성하신 리뷰논문에 기반하고 있는 아래 그림을 기준으로 하여, 대표적인 Next-Generation CAR-T의 개발 방향성에 대해 이해해보고자 한다. 




            

            7.1. 암세포 Targeting 능력을 높여주는 방식

CAR-T의 핵심이라 할 수 있는 "암세포만을 선택적으로 골라서 사멸시키는" 능력을 높여주는 방식으로, 주로 Antigen Specificity가 낮은 Solid Tumor 대상 CAR-T에서 많이 시도되고 있다.


                7.1.1. Self-Driving CAR-T

4차 산업혁명 시대에 걸맞는 자율주행(?) CAR-T는, 바로 Immune Trafficking 측면에서의 접근법이다. Chemokine receptor를 T세포 표면에 같이 발현시켜, 타겟을 잘 찾아갈 수 있도록 해 주는 것이다. 암세포가 특징적으로 분비하는 물질(eg. CCL2)을 인지하는 수용체(eg. CCR2)를 T세포 표면에 발현시킨다면, CAR-T가 암세포를 더 잘 찾아가서 더 선택적으로 공격할 수 있으리라는 컨셉. 위 <5.2.2. Trafficking>에서 Solid Tumor가 분비하는 chemokine을 캐치할 수 있도록 CCR/CXCR을 CAR-T에 발현시키는 것과 비슷한 방식으로 이해하면 될 듯 하다.

(Source: CSM Yong, 2017



                7.1.2 Tandem CAR-T

7.5.의 Conditional CAR-T와 마찬가지로, CAR-T의 Specificity를 높이기 위해 고안된 방법이다. Conditional CAR-T가 서로 다른 2개의 Extracellular Domain이 서로 다른 2개의 Tumor Specific Antigen에 결합하여 양쪽의 Signal을 한개씩 받도록 설계되었다면, Tandem CAR-T는 서로 다른 2개의 Extracellular Domain이 동시에 활성화되어야 신호전달이 이루어지는 구조(Bispecific)로 되어 있다.


이렇게 Extracellular/Intracellular Domain의 구조를 바꿈으로써, 여기붙였다 저기붙였다 하면서 아래와 같이 다양한 시도들이 진행되고 있다. 


(Source: SA Navai, 2016)



                7.1.3. Dual (Trans-signaling, Dissociated-signaling) CAR-T

위 7.8.의 그림에서는 Conditional CAR-T로 표현되어 있는 구조로, CAR-T를 구성하는 2개의 signaling domain을 각각 나누어 발현시킨 구조이다.


(Source: J Hartmann, 2017)


위 4.2.2.에서 CAR-T의 구조를 언급하면서 살펴보았듯이, 기본적으로 CAR-T는 활성화되기 위해서 signaling domain(eg. CD3 zeta, 위 그림 초록색 부분)과 co-stimulatory signal(eg. CD28, 위 그림 주황색 부분)의 2가지 신호가 필요하다. 그래서 2개의 signaling domain을 연속해서 붙여놓은 구조로 제작되는데, 이를 각각 나누어서 존재하도록 (Dissociated Siganling)만드는 것이다. 이 두 signal domain은 암세포에만 특이적으로 발현되는 서로 다른 부위(CD3zeta-Mesothelin, CD28-folate receptor)를 각각 인지하게 되며 CAR-T는 이 두 신호가 모두 있어야 활성화되기에, 결과적으로 암세포에 대한 Specificity를 높여주는 역할을 하게 된다.




            7.2. 면역체계 활성화를 촉진하여 공격력을 높여주는 방식

CAR-T가 암세포를 잘 찾아갔다면, 암세포를 잘 공격하여 효과적으로 죽일 수 있어야 한다. 이는 곧 약효와도 직결되는 부분.


                7.2.1. TRUCK

트럭(?)이라는 요상한 이름의 TRUCK은 T cells Redirected for Universal Cytokine Killing을 뜻하는 말로, 직역하자면 "광범위적인 Cytokine(에 의한) Killing을 유도하는 T세포" 정도의 여전히 알아들을 수 없는 뜻이 된다. 그림과 함께 보면 좀 더 이해가 쉬운데, "CAR-T가 암세포에 결합하게 되면 T세포가 활성화됨과 동시에 Antitumor Cytokine의 분비를 유도하여 공격을 퍼붓겠구나" 정도의 느낌이 온다.


(Source: EMA.europa)


TRUCK에 대해 찾다 보면 IL-12에 대한 언급이 지속적으로 나오는데, 이는 TRUCK의 출발점인 "CAR도 암세포를 공격하고, Innate Immunce Cell도 암세포를 공격한다"는 면역학의 기본에서 출발한다. CAR만으로 암세포를 공격하는 것이 부족하다면 Innate Immune Cell도 동원해서 협공을 하자는 것이고, Innate Immunce Cell을 활성화시키기 위해서 Cytokine을 활용하자는 것이다. IL-12는 Effector Cell들을 효율적으로 recruiting하며 T세포 polarization 및 면역세포 활성화, MHC Class I presentation 등의 면역력 boosting을 해주기에 TRUCK에 사용되고 있다.




위 논문에서는 TRUCKs에 대해 "TRUCKs are are CAR‐redirected T cells used as vehicles to produce and release a transgenic product that accumulates in the targeted tissue"라고 정의하고 있고, 대표적인 "transgenic product"로 proinflammatory cytokine이 있음을 설명하고 있다. 그림에서 보듯이 IL-12를 CAR-T 안에 넣어주고, 방출되는 IL-12를 통해 Mphi, NK cell등의 면역세포들을 활성화하여 암을 공격하는 방식이다. 



                7.2.2. Armoured CAR-T

T세포가 장착할만한 무기가 뭐가 있을까 생각해보면 역시나 암세포를 죽일만한 살상 무기일 것이고, 최근 항암 분야를 점령하고 있는 Checkpoint Inhibitor를 떠올리지 않을 수 없다. Gene modification을 통해 CAR-T세포에 PD-1/CTLA4 등의 Inhibitory Receptor를 없앤다면? T세포는 자제력을 잃고 암세포를 마구 공격하는 능력을 지니게 될 것이다. 


이외에도 T세포가 장착할 수 있는 다양한 무기들을 통칭해서 "Armoured CAR-T"라고 부르고 있는데, 대표적으로 위 7.1.에서 설명한 TRUCK 또한 큰 틀에서의 Armoured CAR-T라고 할 수 있다. CAR-T에 IL-12를 발현시켜 다른 면역세포들을 동원해서 공격력을 높이는 방식이므로.


(Source: OO Yeku, 2016)


위 논문에서 소개하고 있는 또다른 방식의 무기는 CD40L과 4-1BBL이 있다. 요약하자면, 여기서 설명하는 Armoured CAR-T들은 T세포를 활성화시키는 Receptor(CD40, 4-1BB)에 결합하는 Ligand(CD40L, 4-1BBL)를 표면에 발현시켜서, 주변의 면역력을 동원하여 암세포를 공격하는 컨셉으로 이해할 수 있다.


좀 더 자세히 살펴보자. CD40L이 결합하는 CD40은 주로 DC에 발현되는데, 이 경로가 활성화되면 IL-12 및 IFN-r등의 분비로 이어져 antigen presentation이 증가하여 면역력이 활성화된다. 4-1BBL이 결합하는 4-1BB는 위 4.2.2.에서 CAR의 구조를 설명하면서 co-stimulatory signaling domain으로 언급되었던 단백질이며, T세포/NK세포 등에 발현되는 stimulatory signal이므로 당연히 (다양한 경로를 통해) T세포를 활성화시킨다



            7.3. 부작용을 억제하는 방식

그렇다고 CAR-T가 너무 과다하게 활성화되면 여러가지 부작용이 나타날 수 있기에, 활성화 장치만을 넣는 것은 올바른 방법이 아니기도 하다. T세포의 과다한 활성화를 막아주는 것만으로도 많은 개선이 가능하다.



                7.3.1. Universal (Allogeneic, Off-the-shelf) CAR-T

Universal CAR-T는 말 그대로 "유니버셜하게" 사용될 수 있는 CAR-T로, 고형암으로의 확장과 함께 시장에서 가장 기대하고 있는 개발 방향이기도 하다. CAR-T 역시 환자의 면역세포를 활용한 세포치료의 일종이기에 줄기세포와 유사한 부분이 있는데, 환자 본인의 몸에서 유래한 세포를 치료에 활용한다는 점(autologous)이다. 이러한 방식은 customized 라는 측면에서 유리할 수는 있지만, 당연히 상업적 활용성 및 생산비용, 복잡한 절차 등의 제약사항이 존재할 수밖에 없다. 이를 극복하기 위한 것이 여러 환자들에게서 동일하게 사용할 수 있는 기성품 세포치료제(allogeneic)이고, 수억원에 달하는 CAR-T의 비용을 획기적으로 낮출 수 있는 핵심 Pipeline으로 각광받고 있다. 아래 그림에서 보듯이, Universal (Allogeneic) CAR-T의 생산방식은 환자 본인이 아닌 다른 사람(Donor)의 T세포를 사용한다는 것 말고는, 일반적인 Autologous CAR-T와 크게 다르지 않다.





실제로 Universal CAR-T의 개념을 처음 제시한 논문을 보면, "Our goal is to generate off-the-shelf universal CAR+ T cells from allogeneic healthy donors which can be administered to any patient without causing GvHD"라는 개발 목적이 명시되어 있다. 


핵심은, 문장의 끝부분인 "without causing GvHD"에 있다. 결국 T세포가 일으키는 부작용인 GvHD를 일으키지 않는 것이 Universal CAR-T 개발의 가장 핵심이란 뜻인데, 이를 위해서는 TCR을 제거해주는 과정이 필요하다. (이렇게 해서 만들어진 T세포는 CAR를 발현하고 TCR이 없이 때문에, 당연히 CAR+ TCR- T세포로 불린다.)

Universal CAR-T는 다른 사람의 T세포를 사용하기 때문에 이를 "다른 사람"의 것이라고 인식하지 못하도록 하는 작업이 필요한데, 이를 위해서 필요한 것이 바로 TCR을 제거해주는 과정인 것이다. 다른 사람의 T세포에 붙어 있는 TCR이 환자의 몸 속에 있는 항원들을 인지하여 환자를 공격(GvHD)할 수 있기 때문이다. 치료하라고 T세포를 넣어줬더니, 치료는 안하고 정작 환자를 공격하는 셈.


Universal, Allogeneic CAR-T Pipeline을 개발 중인 Cellectis (NASDAQ: CLTS)의 기술 소개를 자료를 보면 이를 알 수 있다. 핵심은 가운데에 있는 CAR-T의 구조로, 오른쪽에 확대되어있는 CAR의 구조는 일반적인 CAR-T와 다르지 않지만, TCR과 CD52에 빨간 X표시가 되어 있고 왼쪽 확대그림에는 TALEN으로 무언가 Gene Editing을 해놓은 것이 보인다. TALEN Gene Editing으로 TCR, CD52의 발현을 억제했다는 뜻. (당연히 처음 쓰인 TALEN 뿐만 아니라 ZFN, CRISPR-Cas9을 이용한 Off-the-shelf CAR-T 제작 사례도 있다)



물론, TCR만 제거한다고 해서 그렇게 쉽게 해결될 문제일리가 없다. 위 4.1.3에 정리되어 있는 CAR의 핵심 구성요소 중, CD3-zeta domain의 기원을 잘 살펴보자. 

그렇다. 얘가 바로 TCR에서 일부분만 떼어온 부분이다. 위에서도 설명하였듯이 CD3-zeta가 신호를 전달하여 T세포를 활성화시키는 과정에서 TCR/CD3 complex의 작용이 필요한데, TCR을 없애버렸다? 당연히 뭔가 신호전달에 문제가 생겨서 T세포 활성화가 잘 일어나지 않을 것 같다는 생각이 들지만... 그렇지 않을 수도 있기에 이런 방식으로 개발이 진행되고 있는 것이겠지..??



(Source: EJ Cheadle, 2013)


처음 구조를 설명할 때 언급했던 대로, CAR는 정상적인 TCR/CD3 complex가 함께 존재할 때 서로 "undefined interaction"을 하면서 작동한다. 다만 그 signaling에 대해 정확히 규명된 바가 없음에도 CD3-zeta 없는 CAR-T들이 많이 개발되고 있으며, 이러한 CAR-TCR interaction에 대해서는 향후 좀 더 공부해볼 분야인 듯 하다.  

 


               7.3.2. Marked CAR-T

CAR-T에 무언가를 표시(Marking) 해놓았다는 것인데, 바로 mAb가 결합할 수 있는 특정 epitope 이다. 이 역시 위 7.5.의 Safety Switch와 비슷하게 T세포가 과다 활성화되었을 경우 이를 제어하기 위해 T세포를 죽일 수 있는 장치를 마련해놓은 것인데, Safety Switch가 특정 물질(CID)을 주입해서 Apoptosis를 유도하는 방식이었다면, Marked CAR-T는 특정 epitope에 결합하는 mAb를 주입함으로써 T세포를 비활성화한다.


(Source: Carl June, 2017)



                7.3.3. Safety (Inhibitory) CAR-T

이름이 주는 어감 그대로, CAR-T에 일종의 안전장치를 설정해 놓은 구조이다. PD-1, CTLA-4 등의 Inhibitory signalling domain을 CAR에 같이 발현시킴으로써 Off-target에서는 CAR의 활성화를 억제시키는 컨셉이다.


(Source: VD Federov, 2013)



            7.4. Customizing하여 원하는 대로 조작하는 방식

위에 언급한 Targetting 능력 증대, 공격력 증대, 부작용 감소 등 다양한 목적을 달성하기 위해 체내로 이미 주입된 CAR-T를 우리가 원하는 대로 컨트롤해보자는 아이디어이다. 


                7.4.1. Self-destruct CAR-T (Safety Switch, Suicide Gene)

CAR-T의 개발 방향이 T세포의 살상능력을 증진시키는 쪽으로 진행되는 과정에서, 나타나는 대부분의 부작용들은 이 살상능력이 과다하게 증진되면서 나타나는 경우가 많다. 필요 이상으로 T세포가 활성화되는 것인데, 이를 막기 위해 T세포를 자살시키는 컨셉이 바로 Self-destruct CAR-T이다. 특정 트리거를 발동시켜 T세포들을 비활성화시키겠다는 개념으로, 2005년에 "Safety Switch"라는 이름으로 제안된 이후 T세포의 공격력 향상과 함께 도입되는 방식으로 활용되어 왔다. 


(Source: T Gargett, 2014)



위 그림이 바로 T세포에 도입되는 Safety Switch의 기본적인 구조이다. iCasp9 (inducible caspase 9)이라고 불리는 단백질을 활용하는 방식인데, 여기에 연결된 drug binding domain에  CID (chemical inducer of dimerisation)가 붙게 되면 Dimer를 형성하면서 Caspase 9을 발현시키고, 이는 순차적으로 proapoptotic molecule을 거쳐 세포의 Apoptosis를 유도하게 된다. 


Suicide Switch를 CAR-T에 도입한 이 논문에서는 IL-15를 활용하여 공격력을 높임과 동시에, T세포의 활성화 정도가 일정 수준 이상으로 올라갈 경우 CID를 투여하여 마우스 체내의 CAR-T들의 사멸을 유도하는 방식의 실험을 고안했고, 결과는 성공적이었다. CID를 투여하고 24시간 후, 상당수의 CAR-T세포들이 사멸한 것이다.



(Source: C&EN, 2018)


Safety Switch는 위와 같은 방식으로 CAR-T에 도입된다. Retroviral vector를 활용하여 CAR 유전자를 도입하는 과정에서 동시에 "Suicide Gene"인 Casp9 유전자가 T세포에 함께 들어가게 되며, CID (위 그림에서는 Rimiducid라는 물질)가 붙게 될 경우 Safety Switch가 켜지고 Casp9 유전자가 발현되면서 CAR-T세포의 Apoptosis가 일어나게 되는 것이다. 



                7.4.2. Conditional CAR-T

Conditional CAR-T는 어감 그대로 특정 조건이 만족되어야만 CAR-T세포가 활성화되는 구조를 가지고 있다. 위 Safety Switch가 특정 조건을 만족하는 경우 CAR-T를 비활성화 시킨 것과 반대로 (On-switch) 작동하는 셈이다. 


(Source: CY Wu, 2015)



이와 비슷한 컨셉으로 한단계 더 앞으로 거슬러 올라가서, CAR의 발현 자체를 conditional하게 조절하는 방법도 있다. GILD가 17년말 $567에 인수한 Cell Design Labs에서 개발 중인 synNotch를 이용한 CAR-T가 바로 이런 케이스로, 아래 그림에서 보이듯이 암세포에 발현되는 특정 marker (e.g. synNotch)를 인지해야 singnaling을 통해 CAR 유전자가 발현된다.


(Source: C&EN, 2018)


            7.4.3. SUPRA CAR-T
지난 4월 말에 발표된, 따끈따끈한 Next Generation CAR-T로, 지현배 박사님 강희원 박사님께서 포스팅으로도 소개하신 바 있으며, $53M을 Funding한 Senti Bioscience라는 회사에서 이를 상업화하여 파이프라인을 개발 중이다. 

SUPRA는 split, universal, programmable의 약자로, T세포를 여러 번 engineering 할 필요 없이 손쉽게 Target을 바꿀 수 있으며 T세포의 활성도 조절 또한 가능한 구조이다.  아래 그림에서 볼 수 있듯이, T세포의 targeting을 결정하는 scFv 부분과 T세포의 활성화를 결정하는 signaling domain을 각각 찢어서 서로 다른 Zip 구조에 나누어서 붙인 뒤, 이 Zip 끼리 연결시켜서 CAR를 완성하는 방식이다. 


(Source: JH Cho, 2018)


zipCAR는 모든 T세포에 발현되는 receptor이며, zipFv는 Tumor-targeting부위에 해당한다. Zip이라는 이름에서 알 수 있듯이 Leucine Zipper를 사용해서 결합하며, 빨간색 부분의 zipFv에 달려 있는 scFv만 바꾸어주면 아래 그림에서처럼 원하는 Target에 T세포를 보낼 수 있다(!!) 이 결합 과정에서 Leucine Zipper 사이의 결합 정도, 항원가 scFv의 결합 정도, zipFv의 양, zipCAR의 발현 정도 등을 조절함으로써 원하는 수준의 CAR-T 활성화를 할 수 있다고 한다. (오히려 조절해야 하는 스위치들이 많아 컨트롤이 더 어려울 수도 있지 않을까...?) 


(Source: JH Cho, 2018)



         7.5. 끝없는 CAR-T의 진화

위에서 보았듯이 수많은 종류의 CAR-T들이 저마다의 방식으로 한단계씩 진화하고 있다. 위에서는 이러한 CAR-T의 진화 방향을 크게 1) T세포의 암세포의 Targeting 능력을 높여주는 방식, 2) 면역체계 활성화를 높여주는 방식, 3) 과다한 활성화로 인한 부작용을 억제하는 방식, 4) 조건부로 활성화/비활성화를 조절할 수 있도록 Customizing 하는 방식으로 구분해 보았는데, Carl June 교수님 연구실에서는 최근 T세포의 Targeting을 늘리는 관점에서 아래와 같이 분류하기도 했다.


이처럼 현재 개발 중인 모든 CAR-T를 모두 살펴보는 것은 무리가 있으리라 생각하고... 이처럼 다양한 CAR-T들을 아름답게(?) 정리해놓은 그림이 있어 소개하고자 한다. 아직 개념을 고안하고 이를 검증해나가는 단계에 블과하기에 상업화까지는 임상이라는 큰 허들을 넘어야 하는 기술들이 대부분이지만, 앞으로 이들 CAR-T의 진화 과정을 살펴보며 어떤 것이 더욱 효과적인지, 시장에서 각광을 받는지 살펴보는 것도 재미있는 관전 포인트가 될 것 같다.



(Source: JE Jaspers, 2017)



 

Reference

Fesnak, Andrew D., Carl H. June, and Bruce L. Levine. "Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy." Nature Reviews Cancer 16.9 (2016): 566.

Jaspers, Janneke E., and Renier J. Brentjens. "Development of CAR T cells designed to improve antitumor efficacy and safety." Pharmacology & therapeutics 178 (2017): 83-91.

Zhang, Cheng, et al. "Engineering CAR-T cells." Biomarker research 5.1 (2017): 22.

Abate-Daga, Daniel, and Marco L. Davila. "CAR models: next-generation CAR modifications for enhanced T-cell function." Molecular Therapy-Oncolytics 3 (2016).

Jackson, Hollie J., Sarwish Rafiq, and Renier J. Brentjens. "Driving CAR T-cells forward." Nature reviews Clinical oncology13.6 (2016): 370.

Zhang, Wenlong. "CAR T-cell therapy: opportunities and challenges." Immunotherapy 8.3 (2016): 245-247.




8. 국내 관련업체 소개


우리나라에도 CAR-T를 개발하고 있는 업체들이 꽤 있다. 집단지성의 힘으로 작성된(?) CAR-T 관련 국내 업체들에 대해 간략하게나마 살펴보고자 한다. 위 7. Next Generation CAR-T에서 분류한 것과 같이, 어떠한 컨셉으로 CAR-T를 개발하고 있는지에 집중해서 보면 재미있을 것 같다. 임상 진입 이전의 전임상, 혹은 그 이전의 초기 단계가 대부분이지만, CAR-T 특성 상 초기 단계에서의 좋은 성과를 기대해볼만 하다. (가나다순)


         8.1. 암세포 Targeting 능력을 높여주는 방식

8.1.1. 바이로메드: 전임상
지난 2017년 11월 미래에셋 바이오투자포럼에서 CAR-T 관련 개발현황을 Update 하였다. 혈액암/고형암 대상으로 개발 중이며, 2020년 임상 1개 진입 및 2022년 임상 3개 진행을 목표로 하고 있다. 유전자를 다루는기술에 특화된 회사 특성을 살려 혈액암/고형암에서 많이 발현되는 CAR 유전자 4개를 선별하였고, 이중 1개는 2015년 Bluebird Bio에 L/O, 1개(VM-802)는 전임상 단계에 있다고 한다. 나머지 2개 (VM-803,804)는 암세포 살상능력이 최대화된 유전자를 선별 중이라고 하는데, CAR-T의 Tumor Specifiity를 높일 수 있는 Antigen을 찾고 있다는 것으로 이해된다(CAR 최적화 기술).

                8.1.2. 앱클론: 초기 연구
지난 2018년 2월, AT-101 파이프라인이 KDDF 과제로 선정되었다. Leukemia/Lymphoma 모두를 대상으로 개발 중인 것으로 보인다. KDDF의 과제 소개를 보면, Kymriah/Yescarta가 사용하고 있는 마우스 유래 FMC63 항체 기반의 CAR에서 나타나는 부작용 (면역원성, CD19 미인식)을 개선하기 위해, 차별화된 Epitope을 갖는 신규 항체를 개발하는 과제라고 한다. 보유하고 있는 Epitope Screening 플랫폼기술인 NEST를 활용하고 있는 것으로 보인다.

                8.1.3. 유틸렉스: 초기 연구
B cell Lymphoma만 선택적으로 공격하는 "MVR CAR-T"를 개발 중이다. 일반적인 CAR-T가 정상 B세포도 공격하는 부작용을 억제하기 위해 악성 B세포에만 선택적으로 결합할 수 있는 방식을 찾았고, 악성 B세포에만 높은 발현량을 보이는 HLA-DR과 결합하는 MVR(Malignant Variant Receptor)이 발현된 CAR-T를 제작하고 있다. 이와 관련된 연구를 최근 Nature에 게재한 바 있다.

                8.1.4. 페프로민바이오-바이넥스 (지분투자): 1H19 IND 예정
PeproMene Bio는 인슐린 의약품 생산으로 유명한 City of Hope의 Larry Kwak 교수 (Kymriah 승인 FDA Ad Com 멤버)가 보유한 CAR-T 기술을 상업화하고 있는 회사. CMO 업체인 바이넥스는 지난 2018년 3월 페프로민바이오의 3자배정 유상증자 참여 형태로 지분투자(10.3%, 107억원)를 하였다. 

페프로민바이오에서는 BAFF-R CAR-T를 개발 중인데, BAFF (B-cell Activating Factor)는 말 그대로 B세포를 활성화시키는 Cytokine이다. 당연히 B세포에 특이적으로 발현되는 수용체 (BAFF-R)가 있을 것이고, 이 수용체에 결합하는 anti-BAFF-R mAb를 활용하여 B세포 질환인 NHL 등을 치료할 수 있을 것이다. 바로 이 B-cell Specificity 높은 BAFF-R 항체의 scFv를 가져다가 CAR-T의 Extracellular Domain으로 쓰겠다는 것이 바로 페프로민바이오의 컨셉.



            8.2. CAR-T의 공격력을 높여주는 방식

                8.2.1. 큐로셀: 2020 1상 진입 예정
국내 최초 CAR-T 전문 업체로 2016년 12월 설립되었다. Lead Pipeline인 CRC019는 CD19 targetting, DLBCL 대상으로 개발 중이며 2020년 임상 진입 예정이다. ALL에 비해 상대적으로 낮은 CRR을 보이는 DLBCL환자들에게서 Checkpoint 수용체 발현을 억제시키는 컨셉이다. BioS의 기사가 있지만 너무 좋은 내용인지라 유료...

                8.2.2. 툴젠: 전임상
툴젠의 대표기술인 CRISPR Cas9 Gene Editing을 활용하여, T세포 기능을 저해하는 유전자인 DGK (DAG Kinase)를 제거한 CAR-T를 개발하고 있다. DAG(diacylglycerol)는 TCR 신호전달에 관여하는 물질로 알려져 있으며, 툴젠은 이를 제거하는 CRISPR 기술을 STYX-T로 명명하고 플랫폼화 하고 있는 것으로 보인다. 몇일 전인 2018년 6월 21일, 대한암학회 컨퍼런스에서 DGK Knock-out CAR-T가 GBM 동물모델에서 종양성장을 성공적으로 억제했다는 결과를 발표했다.



            8.3. 고형암 대상

                8.3.1 유영제약: 18년말 IND 예정
유영제약에서 개발 중인 YYB-103은 국내에서 유일하게 고형암(교모세포종)을 대상으로 개발하고 있는 CAR-T 파이프라인이다. 2014년 경부터 CAR-T 연구를 시작한 것으로 보이며, 동물모델에서 IL-13Ra2를 Targeting한다고 한다. 이런 연구에 기반하고 있는 것 같다.
            


            8.4. Unknown

                8.4.1. 녹십자셀: 진입 준비 중

지난 2017년 11월 600억 CB발행으로 조달한 자금을 통해 현재 용인 Cell Center 구축 중이며, 및 초기 R&D 단계로 보인다. CAR-T는 아니지만 이미 허가까지 받고 연간 100억 이상 판매 중인 이뮨셀-LC (CIK+CTL)의 면역세포 치료제 역량을 활용한다는 계획.


                8.4.2. 바이오큐어팜-파로스백신 (협력): 2H18 1상 진입 예정

국내 최초 캐나다 상장사인 바이오큐어팜의 해외 네트워크 및 R&D 경험, 파로스백신이 보유하고있는 CAR 유전자 제조기술, Viral Vector 생산/제조기술, 세포증식기술, 세포처리시설 등의 인프라를 활용하는 협력 구조라고 한다. 파로스백신에서 파이프라인을 올리면 바이오큐어팜에서 전임상 이후를 진행하여 사업화하는 방식. Kymriah와 동일하게 ALL 대상으로 CD19 Targetting하는 것 까지만 공개된 듯 하다. 2018년 2월 전임상 진입, 올해 하반기 글로벌 1상 진행 예정.


                8.4.3. 박셀바이오 :진입 검토 중

다발성 골수암 대상 DC 치료제 (Vax-DC/MM), 간암 대상 NK cell 치료제 (Vax-NK/HCC) 중심의 면역세포치료제를 개발 중이며, CAR-T 연구도 하는 것으로 보인다.


                8.4.4. 이뮨온시아-유한양행 (지분투자/협력): IND 준비 중

바이오벤처들과 다양한 형태의 협력을 하고 있는 회사 답게, CAR-T는 Sorrento Tx (NASDAQ: SRNE)와 51:49로 설립(120억 투자)한 JV인 이뮨온시아에서 개발 중이다. 소렌토에서 개발한 후보물질을 이뮨온시아에서 전임상/임상을 진행하는 구조. 우선적으로 개발 중인 IMC-001은 Anti-PD-L1 Ab로 1상 진행 중이며, CAR-T 파이프라인은 알려진 바가 없지만... 개발 중이라고 한다. Sorrento의 홈페이지에서 미루어 보건대, Multiple Myeloma 환자를 대상으로 하는 CD38 CAR-T를 우선적으로 개발하고 있는 듯 하다.


                8.4.5. LG화학: 진입 검토 중

지난 2017년 2월 한미약품 CMO 출신 손지웅 본부장의 영입 이후 면역항암제 R&D를 주력 과제로 삼고, CAR-T 기술 도입을 검토 중이라고 한다.





9. 기타 고려사항들


           9.1. 높은 약가 및 Reimbursement

지금까지 살펴본 CAR-T는 그 과정부터 복잡하다. 환자에게서 혈액을 뽑고, T세포만 분리해낸 다음 복잡하게 설계된 CAR 유전자를 도입하고, 증식시키고, 다시 환자의 체내에 집어넣는다. 이렇게 만들어진 Kymriah의 약가(WAC)는 1회 치료에 $475,000, Yescarta는 $373,000이다. 2018년 4월 CMS에서 이들에 대한 보험급여를 발표했지만, 어찌되었건 "비싼" 약들이다. 이는 기본적으로 복잡한 생산과정에 기인하며, 이를 적극적으로 해결하고자 하는 것이 위 7.3.1.의 Off-the-shelf CAR-T이다. 맞춤 약이어서 비싼 상황이니, 부작용을 없앤 기성품을 만들어서 값싸게 공급하자는 컨셉이다. 향후 추가적으로 허가될 CAR-T의 약가는 어떻게 될지, 얼마나 많은 사람들이 이 치료를 받을 지 등에 대해서 지켜볼 일이다.


 

           9.2. 중국, 중국, 중국

CAR-T에서도 중국이 무섭다. 전세계적으로 진행되고 있는 CAR-T 임상 중 절반 가까이가 진행되고 있으며, Nanjing Legend Biotech과 같은 플레이어들이 갑자기 튀어나오는 나라가 바로 중국이다. 앞으로 CAR-T에서도 중국의 행보에 주목해야 할 듯.


(Source: C June, 2018)



           9.3. Logistics

위 3.4.의 그림에서 설명하고 있듯이, CAR-T는 매우 복잡하고 많은 과정이 필요한 "치료방법"이다. 생산 경쟁력을 갖춘 공장에서 만들어진 의약품을 전세계로 배송하고, 병원/약국에서 보관하고 있다가 필요할 때 꺼내 쓰는 기존의 "의약품"과는 그 밸류 체인이 전혀 다르다. 그렇기에 환자의 혈액을 채취할 때부터 CAR-T를 주입하고 치료 경과를 살펴보는 모든 과정까지가 (당연한 말이지만) 유기적으로 연결되어 있어야 하며, 이것이 높은 약가를 받을 수 밖에 없는 요인이기도 하다. Off-the-shelf CAR-T에 기대를 거는 또하나의 이유.


(Source: BL Levine, 2017)

 


Outro

 

CAR-T는 그 내용이 매우 방대하고, 하루가 다르게 변화한다. 이 글을 작성하는 약 3개월 정도의 기간 동안에도 계속해서 새로운 내용들이 업데이트되었고, 어떤 Depth까지 커버할 것인지에 대해서도 혼란스러웠다. Oncology라는 거대한 분야 중에서도 가장 핫하게 떠오르는 분야인 만큼, 여기서 다루지 못한 수많은 CAR-T의 세부 주제들이 있다. 새롭게 등장한 고형암 타겟들, TCR-T, 병용투여, 그리고 이들을 상업화 하고 있는 전세계의 수많은 회사들...

다만 나의 Initiation 글들이 그러하듯이 새로운 내용들을 접할 때 이게 어디쯤에 속하는 내용인지 전체적인 Outlook을 그리고자 하는 것이 목적이었으므로, 그 목적은 (스스로) 충분히 달성한 것 같다. 애초에는 JunoKiteCelyadAllogeneAuroraMustangCellectisNanjing 등 CAR-T로 대표되는 회사들의 파이프라인을 살펴보고자 하는 생각으로 시작하였으나... 정작 이 내용은 담지 못했는데 향후 개별 기업 Coverage를 시작할 때 묶어서 다뤄볼 예정이다. 그때쯤이면 CAR-T의 진행 상황도 많이 진척되어 있을 것이라 생각한다. (결국 글은 나~~중에 쓰겠다는 뜻)


아래 내용들은 CAR-T에 대해 전반적으로 다루고 있어, 살펴보기에 좋은 자료들이다. 

 

CAR-T, 블록버스터 약물 될 수 있을까? (바이오스펙테이터, 2018.06.)

ASCO 2018 후기: 무대는 준비됐다 (IBK투자증권, 박시형, 2018.06)

 

 




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